Роль 24-годинного прекондиціювання нейропротекторами у виживаності нейронів при колхіцин-індукованій нейродегенерації in vitr

Abstract

Колхіцин-індукована нейротоксичність є цінним експериментальним інструментом для моделювання порушень аксонального транспорту – патологічного процесу, асоційованого з розвитком і прогресуванням нейродегенерації при хворобі Альцгеймера, хворобі Паркінсона та травматичних ураженнях головного мозку. Водночас механізми нейрональної загибелі та стійкості до дії цього нейротоксину залишаються предметом активних досліджень. Метою представленого дослідження було оцінити вплив 24-годинного прекондиціювання цитіколіном і тіоцетамом на виживаність клітин первинної культури ембріональної нервової тканини за умов дії колхіцину. Дослідження проводили на первинній культурі нейронів, яку розподілили на інтактну групу, групу з 24-годинною експозицією колхіцину в концентрації 1 мкМ та групи з попередньою нейропротекторною корекцією. Фармакологічне прекондиціювання здійснювали шляхом добової інкубації клітин у середовищі, що містило цитіколін (100 мкМ) або тіоцетам (1 мМ), із подальшим додаванням токсиканту. Надалі клітини фіксували та піддавали цитохімічному забарвленню на субстанцію Ніссля для світлової мікроскопії, а також імунофлуоресцентному дослідженню експресії каспази-3 (casp3) і циклооксигенази2 (cox2). Встановлено, що експозиція колхіцину спричиняє дезорганізацію субстанції Ніссля, підвищення експресії casp3 та виражену прозапальну відповідь за маркером cox2. Попереднє застосування цитіколіну та тіоцетаму дозволило достовірно знизити частку апоптотичних клітин на 60,8% і 42,9% відповідно, хоча повного відновлення показників до рівня інтактного контролю досягнуто не було. Досліджувані нейропротектори продемонстрували виражені антиапоптотичні властивості, однак виявилися менш ефективними щодо корекції морфологічних ознак хроматолізу та інтенсивності експресії cox2. Colchicine-induced neurotoxicity is a valuable tool for replicating axonal transport disruption in both in vivo and in vitro experiments – a pathological process associated with the development and progression of neurodegeneration in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, as well as traumatic brain injuries. However, the mechanisms of neuronal death and resistance to this neurotoxin remain subjects of active research. Objective. The purpose of this study was to describe the effect of 24-hour preconditioning with citicoline and thiocetam on cell survival in a primary culture of embryonic nervous tissue under the influence of colchicine. Matherials and methods. The study was conducted on a primary neuronal culture divided into an intact group, a group with 24-hour exposure to 1 μM colchicine, and groups with prior neuroprotective correction. Pharmacological preconditioning was performed by incubating cells for 24 hours in a medium containing either citicoline (100 μM) or thiocetam (1 mM) before the subsequent addition of the toxicant. Subsequently, the cells were fixed and subjected to cytochemical Nissl staining and immunofluorescent analysis of caspase-3 (casp3) and cyclooxygenase-2 (cox2) expression. Results. The analysis demonstrates that colchicine exposure causes disorganization of the Nissl substance, increased casp3 expression, and a pronounced pro-inflammatory response according to the cox2 marker. Prior application of citicoline and thiocetam significantly reduced the proportion of apoptotic cells by 60.8% and 42.9%, respectively, although it did not provide full restoration of the parameters to the level of the intact control. The investigated neuroprotectors demonstrated significant anti-apoptotic properties but were less effective in correcting the morphological signs of chromatolysis and the intensity of cox2 expression. Conclusions. 1. 24-hour exposure to colchicine in primary neuronal culture is characterized by profound tigroid disorganization (a twofold increase in staining heterogeneity), activation of caspasedependent apoptosis (a 20-fold increase in caspase-3 expression intensity with the involvement of 87.5% of cells), and stimulation of inflammation (a 5.8-fold increase in cyclooxygenase-2 expression intensity).2. Pharmacological preconditioning with the studied drugs is associated with a decrease in the number of casp3+-cells by 60.8% (citicoline) and 42.9% (thiocetam), but does not affect the fluorescence intensity compared to the colchicine group. At the same time, 24-hour pre-incubation with both drugs proved insufficient for the full restoration of the tigroid structure or the complete neutralization of cyclooxygenase-2 expression intensity, demonstrating only a trend towards the normalization of these parameters.