Immunohistochemical analysis of microglial changes in the experimental acute hepatic encephalopathy

Abstract

Hepatic encephalopathy (HE) is a syndrome of impaired brain function in patients with advanced liver failure and it manifests in form of psychometric tests alterations up to decreased consciousness and coma. The current knowledge about HE mainly focused on the theory of ammonia neurotoxicity and neuroinflammation. Microglia being resident innate immune cells of the brain when activated are responsible for the neuroinflammatory reactions. The aim – immunohistochemical study of the microglial changes in different rat brain regions in conditions of experimental acute HE (AHE). Materials and methods. We used acetaminophen induced liver failure model in Wistar rats. Four from 10 animals that survived up to 24 h after acetaminophen injection constituted “compensated group”; 6 animals which died within 24 h – “decompensated group”. Microglial reactive changes were analysed by the evaluation of the relative area (S rel., %) of CD68+ expression in the brain cells not associated with meninges and vessels, as well as the changing in shape and number of these cells. Results. Acetaminophen-induced AHE in rats was characterized by the regional- and time-dependent dynamic increase in CD68 expression level in the rat brain in form of significant (relatively to control) increase of CD68+ S rel. in brain cells and the number of such cells. The medians of CD68+ S rel. and their numbers in significantly changed regions of non-survived rats were, respectively: subcortical white matter – 0.24 (0.20; 0.26) and 11.00 (8.00; 13.00); thalamus – 0.13 (0.90; 0.18) and 6.00 (3.00; 7.00); caudate/putamen – 0.13 (0.12; 0.18) and 7.00 (4.00; 11.00) – all indicators were statistically significant compared to control. In the survived animals, indicators were, respectively: subcortical white matter – 0.24 (0.16; 0,26) and 10.00 (8.00; 12.00); caudate/putamen – 0.12 (0.10; 0.15) and 6.00 (4.00; 10.00) – the differences were significant compared to control. Conclusions. The highest and significant indicators were revealed at 24 h (compared to earlier time points) of the experiment in the white matter, thalamus and caudate/putamen. This fact reflects time-dependent dynamic boosting of reactive changes in microglia and presumably may indicate the regions of the most active neuroinflammatory response within the brain parenchyma in the conditions of AHE. The appearing of a small percentage of cells with amoeboid transformation among CD68+-cells may mean partial functional insufficiency of such cells due to probable suppressive impact of ammonia or other influencing factors, as well as insignificance of the material that needs to be phagocytosed under established conditions. Печінкова енцефалопатія (ПЕ) – синдром порушення функції мозку в пацієнтів із вираженою печінковою недостатністю, що може маніфестувати як зміни психометричних тестів і поглиблюватися до зниження свідомості з розвитком коми. Сучасні уявлення про ПЕ зосереджені передусім на теорії нейротоксичності аміаку та нейрозапаленні. Мікроглія, що представляє резидентний пул клітин вродженого імунітету в мозку, після активації може викликати нейрозапальну відповідь. Мета роботи – імуногістохімічне визначення мікрогліальних змін у різних ділянках мозку в умовах експериментальної гострої ПЕ (ГПЕ). Матеріали та методи. Використали модель ацетамінофен-індукованої печінкової недостатності у щурів лінії Wistar. Чотири тварини (із десяти), які вижили в термін до 24 годин після ін’єкції ацетамінофену, – компенсована група; 6 тварин, які загинули протягом 24 годин, – декомпенсована група. Мікрогліальні реактивні зміни оцінювали шляхом аналізу відносної площі (S rel., %) експресії CD68+ у клітинах мозку, що не пов’язані з мозковими оболонками та судинами, а також за змінами форми та кількості таких клітин. Результати. Індукована ацетамінофеном ГПЕ у щурів характеризувалася регіональним і динамічним у часі зростанням рівня експресії CD68 у мозку: виявили вірогідне щодо контролю збільшення CD68+ S rel. у клітинах мозку та кількості таких клітин. Медіани CD68+ S rel. (%) і кількість CD68+-клітин у ділянках мозку зі значущими кількісними змінами у померлих щурів становили: підкіркова біла речовина – 0,24 (0,20; 0,26) та 11,00 (8,00; 13,00); таламус – 0,13 (0,90; 0,18) та 6,00 (3,00; 7,00); хвостате ядро/путамен – 0,13 (0,12; 0,18) та 7,00 (4,00; 11,00) відповідно. Усі показники, що наведені, статистично вірогідно більші порівняно з контрольними. У тварин, що вижили, показники становили: підкіркова біла речовина – 0,24 (0,16; 0,26) та 10,00 (8,00; 12,00); хвостате ядро/путамен – 0,12 (0,12; 0,15) та 6,00 (4,00; 10,00) відповідно; показники вірогідно більші щодо контролю. Висновки. Найвищі та вірогідні показники встановлені на 24 годині експерименту (порівняно з попередніми часовими періодами) в білій речовині, таламусі та хвостатому ядрі/путамені. Цей факт підтверджує регіон-залежне, динамічне в часі посилення реактивних змін мікроглії, що може вказувати на ділянки розвитку найактивнішої нейрозапальної відповіді в паренхімі мозку в умовах ГПЕ. Наявність серед CD68+-клітин невеликого відсотка клітин з амебоїдною. Печеночная энцефалопатия (ПЭ) – синдром нарушенной функции мозга у пациентов с выраженной печеночной недостаточностью, который может манифестировать в виде изменений психометрических тестов и усиливаться до снижения сознания вплоть до развития комы. Современные представления о ПЭ сосредоточены преимущественно на теории нейротоксичности аммиака и нейровоспалении. Микроглия, представляющая резидентный пул клеток, отвечающий за врожденный иммунитет в мозге, после активации способна инициировать нейровоспалительный ответ. Цель работы – иммуногистохимическое определение микроглиальных изменений в различных областях мозга в условиях экспериментальной острой ПЭ (ОПЭ). Материалы и методы. Использована модель ацетаминофен-индуцированной печеночной недостаточности у крыс линии Wistar. Четверо животных (из десяти), которые выжили в срок до 24 часов после инъекции ацетаминофена, – компенсированная группа; 6 животных, погибших в течение 24 часов, – декомпенсированная группа. Микроглиальные реактивные изменения оценивали путем анализа относительной площади (S rel., %) экспрессии CD68+ в клетках мозга, не связанных с мозговыми оболочками и сосудами, а также по изменениям формы и количества таких клеток. Результаты. Индуцированная ацетаминофеном ОПЭ у крыс характеризовалась региональным и динамическим во времени ростом уровня экспрессии CD68 в мозге крыс в виде достоверного относительно контроля увеличения CD68+ S rel. в клетках мозга и количества иммунопозитивных клеток. Медианы CD68+ S rel. (%) и количество CD68+-клеток в регионах мозга с существенными количественными изменениями у умерших крыс составили: подкорковое белое вещество – 0,24 (0,20; 0,26) и 11,00 (8,00; 13,00); таламус – 0,13 (0,90; 0,18) и 6,00 (3,00; 7,00); хвостатое ядро/ путамен – 0,13 (0,12; 0,18) и 7,00 (4,00; 11,00) соответственно. Все показатели статистически достоверно выше контрольных. У выживших животных показатели составили: подкорковое белое вещество – 0,24 (0,16; 0,26) и 10,00 (8,00; 12,00); хвостатое ядро/путамен – 0,12 (0,12; 0,15) и 6,00 (4,00; 10,00) соответственно; показатели достоверно выше контрольных. Выводы. Самые высокие и достоверные показатели отмечены к 24 часам эксперимента (по сравнению с предыдущими временными периодами) в белом веществе, таламусе и хвостатом ядре/путамене. Этот факт подтверждает регион-зависимое, динамическое во времени усиление реактивных изменений микроглии и в определенной степени может указывать на области наиболее активной нейровоспалительной реакции в паренхиме мозга в условиях ОПЭ. Наличие среди CD68+ -клеток небольшого процента клеток с амебоидной трансформацией может означать их частичную функциональную недостаточность из-за вероятного подавляющего влияния аммиака или других факторов, а также не исключает образование в таких условиях несущественного количества тканевого материала, предназначенного для фагоцитоза.